物理灭菌法
（一）加热灭菌法
加热可破坏微生物中酶、蛋白质和核酸，导致微生物死亡。加热灭菌又分干热灭菌法和湿热灭菌法。在同一温度下，湿热灭菌的效果比干热灭菌好。主要是因湿热灭菌时，有水分存在，蛋白质容易变性。水分又易使微生物膜壁润湿，湿热的穿透力比干热大。
干热灭菌法 常用的有火焰灭菌法与干热空气灭菌法两种。
（二）紫外线灭菌法
是指用紫外线照射杀灭微生物的方法。一般用于灭菌的紫外线波长是200~300nm，灭菌力最强的波长是253.7nm。紫外线作用于核酸蛋白促使其变性，同时空气受紫外线照射后产生微量臭氧，从而起共同杀菌作用。紫外线进行直线传播，可被不同的表面反射，穿透力微弱，但较易穿透清洁空气及纯净的水。因此本法适用于照射物体表面之灭菌、无菌室的空气及水的灭菌；不适用于药液的灭菌、固体物质深部的灭菌；普通玻璃可吸收紫外线，因此装于玻璃容器中的药物不能用此法灭菌。紫外线对人体照射过久，会发生结膜炎，红斑及皮肤烧灼等现象，故一般在人入室前开启紫外线灯1~2小时，关闭后人才进入洁净室。如果必须在人进去后仍要开紫外线灭菌，则人的皮肤及眼睛应有有效的防护措施。一般在6~15m3的空间可装置30瓦紫外线灯一盏，离地面2.5~3m为宜。
用紫外线照射灭菌时要注意下列问题：
1、紫外线的杀菌力，随使用时间增加而减退，一般使用时间达到额定时间70%时应更换紫外线灯管，以保证杀菌效果。国产紫外线灯平均寿命一般为2000h。
2、紫外线的杀菌作用随菌种不同而不同，杀霉菌的照射量要比杀杆菌大40~50倍。
3、紫外线照射通常按相对湿度为60%的基础设计，室内湿度增加时，照射量应相应增加。
4、紫外线灭菌效果与照射的时间长短有关，这需要通过验证来确定照射时间。
5、紫外照射灯的安装形式及高度，应根据实际情况,参考使用说明决定。
灭菌方法的验证采用生物指示剂挑战试验，生物指示剂多用枯草芽孢杆菌。
（三）微波灭菌法
微波是指频率在30~3000MHz之间的电磁波。水可强烈地吸收微波，使其极性分子转动，分子间的磨擦而生热，且升温迅速，靠热力而灭菌。在数十秒至几分钟之内可达100～150℃，并全部杀死液体中的微生物，适于水溶性注射液的灭菌。另外，固体药材饮片及固体制剂（丸剂、散剂、胶囊粉等）也含少量水分，微波能穿透到固体内部，由表至里被均匀加热，而起干燥、灭菌的作用。多用于口服液体制剂的灭菌，有望用于注射液的灭菌。但可能对某些药品的PH值、含量、颜色有影响。
（四）辐射灭菌法
辐射灭菌是应用γ射线、β射线杀灭细菌的方法，又称电离辐射，前者由钴-60或铯-137发出，穿透力强；后者由电子加速器产生，带电荷，穿透力弱，灭菌效果差。
化学灭菌法
化学灭菌法系指用化学药品来杀灭微生物的方法。同一种化学药品的低浓度时呈现抑菌作用，而在高浓度时则能起杀菌作用。其杀菌机理可能是：能使微生物蛋白质变性死亡，或与酶系统结合影响代谢，或改变膜壁通透性使微生物死亡等。常用的方法有消毒剂消毒法和化学气体灭菌法等。
（一）消毒剂消毒法
消毒是指杀死病原微生物的方法。但化学消毒剂大多仅能杀死微生物的繁殖体而不能杀死芽孢，能控制一定范围的无菌状态。可将消毒剂配成适宜浓度，采用喷淋、涂擦或浸泡等方法对物料、环境、器具等进行消毒。常用的化学消毒剂有0.1%～0.2%苯扎溴铵溶液、3%～5%的酚或煤酚皂溶液、75%乙醇等。常用于物体表面灭菌。但要注意其浓度不要过高，以防止化学腐蚀作用。洁净室的墙面、天花板、门窗、机器设备、仪器、操作台、车、桌、椅等表面以及人体双手（手套）在环境验证及日常生产时，应定期清洁并用消毒剂喷洒，无菌室用的消毒剂必须在层流工作台中，用0.22μm的滤膜过滤后方能使用。
（二）化学气体灭菌法
系指利用化学药品的气体或产生的蒸汽进行杀灭微生物的方法。
1.环氧乙烷灭菌法
环氧乙烷灭菌法是利用环氧乙烷气体进行杀菌的方法。它是一种传统的灭菌方法，可应用于工衣灭菌、不耐加热灭菌的药品、医用器具、设施、设备等的灭菌。
环氧乙烷灭菌系统，主要有下列四项互相制约的重要因素影响灭菌效果：
1、温度；2、湿度；3、气体浓度；4、灭菌时间。
因为环氧乙烷是易燃易爆物质，明火可以引起燃烧，同时由于气体分解还可能引起爆炸，环氧乙烷灭菌中应十分注意安全问题。
2.甲醛等蒸汽熏蒸法
采用甲醛、丙二醇或过氧醋酸等化学品，通过加热产生蒸汽进行空气环境灭菌。
(1)、计算房间体积，按10g/m3的比例称出甲醛。
(2)、将甲醛倒入甲醛发生器或加热盘或烧杯中，并放好加湿用水，必要时还需加入高锰酸钾（2~3g/m3），然后加热（甲醛发生器用蒸汽加热，加热盘或烧杯用热水盛入其中加热）使其蒸发成气体。
(3)、灭菌流程：空调器停止运转→启动甲醛气体发生器或在加热盘中加热甲醛 →让甲醛气体扩散约30分钟→启动空调器让甲醛气体循环约30分钟→停止空调器，房间熏蒸消毒，时间不少于8小时→ 房间排气，用新鲜空气置换约2小时→ 恢复正常运行。
当相对湿度在65%以上，温度在24~40℃时，甲醛气体的消毒效果最好。
3、臭氧消毒法
臭氧（O3）的消毒原理是：臭氧在常温、常压下分子结构不稳定，很快自行分解成氧（O2）和单个氧原子（O），后者具有很强的活性，对细菌有极强的氧化作用，臭氧氧化分解了细菌内部氧化葡萄糖所必须的酶，从而破坏其细胞膜，将其杀死。多余的氧原子则会自行重新结合成为普遍氧分子（O2），不存在任何有害残留物，故称为无污染消毒剂。它不但对种种细菌（包括肝炎病毒、大肠杆菌、绿脓杆菌及杂菌等）有极强的杀灭能力，而且对霉菌也很有效。